耐有机相氧化亚铁硫杆菌的驯化及培养特性研究(3)
8）硫磷混酸：边搅拌边将200mL磷酸注入约500mL水中，再加300mL硫酸，混匀，流水冷却。
用吸管吸取2mL静置待测清液，加入10mL硫磷混酸，在不断搅拌下，立即用0.01667mol/L的重铬酸钾溶液（K2Cr2O7）进行滴定，直至溶液由无色变成紫色为终点，读取并记下重铬酸钾的用量V。
溶液中铁离子浓度X（g/mL）按下式计算：
X=6×55.85×0.001C0V/2=0.1676C0V (2.1)
式中：V—滴定试液时消耗的重铬酸钾标准溶液的体积，mL
C0—重铬酸钾标准溶液的浓度，mol/L
二价铁氧化率计算公式如下：
氧化率=初始浓度C0—不同时间的浓度C1/初始浓度C0 （2.2）
试中的浓度均为计算出来的二价铁浓度，单位mol/L
2.2.2 血球板计数法
实验驯化中每到菌株达到稳定期进行一次培养基中有机相（煤油+Lix84n）梯度变化培养，稳定期的衡量标准通过测定T.F菌株数的稳定来判定，菌株计数法采用：血球板计数法。定期取样计算嗜酸性氧化亚铁硫杆菌数量，绘制细菌生长曲线，直至菌体数目稳定，实验结束。
2.2.2.1 操作步骤
1）配置菌悬液：将样用单层纱布过滤，摇晃后用移液管取适量的样品至容量瓶中稀释（稀释情况依菌数量定。）
2）镜检计数：将干净的血球计数板放置在显微镜下，视野内若有菌，重新清洗，直至完全清洁。
3）制板：取干净的载玻片，放置血球计数板的中央，用胶头滴管轻轻的沿盖玻片边缘滴入（两侧均滴），放平，用吸水纸吸取边缘多余的菌液，静止约5分钟。
4）计数：选取5个中方格（每个中方格内有16个小方格）计数，格线上的一般只数上方和右方的。
5）清洗血球计数板,轻轻放置在酒精瓶中。
2.2.2.2 计算
每毫升细菌个数=50000×菌液稀释倍数×5个小方格中的细菌个数
2.3 实验方法
2.3.1菌种的来源
本实验选用的菌种为实验室保存的氧化亚铁硫杆菌。并通过多次接种于转接，使菌种在9K培养基中培养，使其活性得到恢复。
2.3.2 9K培养基
(NH4)2SO 4 1.5g，K2HPO4 0.5g，KCL 0.10g，MgSO4•7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.01g ,蒸馏水3000mL,调节pH2.0，121℃灭菌20min；加入经过除菌的FeSO4•7H2O 44.22g，用浓硫酸（5mol/L），将pH调节到2.0。这里的FeSO4•7H2O是通过紫外线照射2h灭菌。
2.3.4 驯化方法
本实验驯化菌株的方法为以嗜酸性氧化亚铁硫杆菌菌(A．F)供试菌株，通过比较驯化前后的菌氧化培养基中全部氧化亚铁的所需时间，研究了氧化亚铁硫杆菌驯化菌株的抗有机相机理。以提高T.F菌在萃取后对有机相的抗性。为了模拟真实生产工艺，实验将采用1:1体积进行萃取，过程均为摇晃30s，静置5min。而后将培养基灭菌。
1、取新配制的9 K培养基于50 mL锥形瓶中，制备其有机相浓度（均为体积比）分别为0%、1.5%、2.5%、5%四组，对50mL的培养基进行1:1萃取后调pH值为2，实验过程中采用1：1的硫酸（5mol/L）调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。
2、经由1.5%有机相萃取后的培养基，接入要驯化的处于对数期或者稳定期的氧化亚铁硫杆菌，接种量为2%，进行30℃恒温，摇床120r/min培养。随后定时取样用血球计数法测定T.F菌的菌数及用重铬酸钾滴定测亚铁离子的浓度。
3、待细菌适应并能正常生长后，即到达稳定期的时候，稳定期由细胞数稳定来鉴定。将它再转移到用同样浓度有机相萃取的培养基中继续培养，并依此类推，每个有机相浓度驯化三遍，每转移一次，都对亚铁离子浓度进行每隔12h的全程测量，三遍以后都提高相应的有机相浓度，但是两次转接之间的梯度不能过大，否则达不到好的效果。
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