模拟群体感应合作行为的基因回路的效果验证(10)
表3.2 T4连接酶反应体系组分
反应物 体积/μL
pEGFP-C1+ 5.0
pPopCtrl1 5.0
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.0
T4 DNA Ligase 1.5
ddH2O 7.0
由于割胶回收率低，连接后的目的质粒无法在琼脂糖凝胶电泳上反映出来，只能转化后，扩菌验证。
3.25 目的质粒的转化及验证
由于连接可能出现多种质粒，而目的质粒只有一种，因此要将连接产物转化到Top10F菌中进行验证。利用目的质粒含抗卡那霉素基因与PUC18，在含卡那霉素的LB平板上利用β-半乳糖苷酶与X-gal反应变蓝来做蓝白斑验证，结果如表3.3:
表3.3刚转化后工程菌的蓝白斑验证结果
编号 细菌 碳源与诱导剂 实验时间 实验结果
a Top10F 乳糖
24小时 白色菌落
b T 乳糖 白色菌落
c T 乳糖IPTG 白色菌落
在含有卡那霉素与X-gal平板上所有的细菌均变蓝。理论上3913bp段基因自身环化形成质粒，转化进入Top10F可以在含有卡那霉素与X-gal平板上生长，但长出的菌落理论上应该是白色。如果这类菌落变成蓝色，可能原因是通过群体感应，这类细菌利用别的细菌产生的β-半乳糖苷酶。因此所有的菌落才会呈现蓝色。