模拟群体感应合作行为的基因回路的效果验证(9)
为构建目的质粒，本课题利用人工合成的一段包含有AatⅡ酶切位点和LacZα的490bp基因片段和用AatⅡ限制性酶切pPopCtrl1质粒回收的3913bp基因片段，通过T4 ligase 酶将两段序列连接起来，构建目的质粒，将其导入Top10F菌株中，形成新的工程菌模型。其中490bp的片段包括pUC18中的lacZα片段并在pUC18的lacZα片段两端添加lacZα基因末端到AatⅡ酶切位点当中的序列，lacZα、两端添加的序列及总的490bp的序列依次如下：
第一段15bases：5'-gacgtcgcctgacat-3'
第二段324bases：lacZ-alpha基因，来自pUC18
第三段151bases：
490bp的基因：
5'-gacgtcgcctgacatctatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatcatggtcataccaacctcccttgcgtttattcgactataacaaaccattttcttgcgtaaacctgtacgatcctacaggtgcttatgttaagtaattgtattcccagcgatacaatagtgtgacaaaaatccaatttattagaatcaaaggactgacgtc-3'
本课题利用限制性内切酶AatⅡ的专一性，酶切捷瑞公司合成含有目的片段的pEGFP-C1+质粒和实验室已有的pPopCtrl1质粒，产生相同的黏性末端，通过琼脂糖凝胶电泳找到目的条带，割胶回收目的DNA，使用T4 DNA连接酶连接两条DNA，合成目的质粒pPop-galac，将目的质粒转化进入不含质粒的TOP10F菌株中，对转化后的细菌进行蓝白班筛选，经过琼脂糖凝胶电泳和酶切验证，排除错误的连接方式，得到所需的正确pPop-galac质粒。进行群体感应效果验证初步实验，在细菌的种群的密度达到一个阈值后，原来不能利用乳糖的细菌开始可以利用乳糖，出现二次生长。
3.2实验结果与分析
3.21提取质粒
捷瑞公司的质粒DNA小量制备试剂盒从WT与ST305所提取质粒pEGFP-C1+(含有LacZα)和pPopCtrl1（含有卡那霉素抗性基因）电泳结果如图3.1：
图3.1WT中提取出的pPopCtr11与ST305中提取出的pEGFP-C1+的琼脂糖凝胶电泳图
pEGFP-C1+质粒大于4731bp，pPopCtrl1质粒大小为4727bp。由于质粒呈环状，会出现超螺旋结构，实际电泳显示的结果会比真实值小。因此图3.1中显示出质粒大小属于正常情况。
3.22 质粒的酶切
用AatⅡ酶对提取的pEGFP-C1+和pPopCtrl1质粒进行酶切， pEGFP-C1含有多个AatⅡ酶切位点，切开的片段比较多， 490bp的片段是目的基因所在的片段。pPopCtrl1质粒则有两个AatⅡ酶的酶切位点，酶切出两段DNA，大小为3913bp的DNA含有目的基因。AatⅡ酶切体系见表3.1：
表3.1AatⅡ酶的酶切体系
反应物 体积/μL
见下一页
续表：
超纯水 6.0
缓冲液 2.0
DNA 10.0
AatⅡ 1.0
AatⅡ酶酶切的结果如图3.2：
图3.2AatⅡ酶酶切pPopCtr11和Pecfp-C1+后的电泳图
pEGFP-C1+和pPopCtrl1质粒酶切产生了所需的3913bp和490bp片段。因为切割后质粒呈现线状，所以实际大小与测量值相符。通过多泳道的割胶回收提高目的DNA的回收率。
3.23目的条带的割胶回收
使用捷瑞公司的GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对酶切的目的基因进行割胶回收，对回收的片段进行电泳验证，电泳结果如图3.3：
图3.3 割胶回收目的基因的琼脂糖凝胶电泳图
回收得到的片段大小正确，回收产物浓度较小，说明割胶回收率低。
3.24 酶切产物的连接
割胶回收的目的基因用电泳验证后，使用T4 DNA连接酶连接，T4 DNA连接酶反应体系的组分见表3.2：