9    先加IPTG,生长到17小时加入乳糖    
10    乳糖,IPTG    
11    乳糖,IPTG    
12    乳糖,IPTG    
分别在6.0h,7.5h,9.5h,11.5h,13.5h,15.5h,17.0h,19.0h,21.0h,23.0h,25.0h,26.5h,27.0h,28.5h的时间点从试管中取菌液200uL加入96孔板中,利用酶标仪在600nm可见光波长下测定OD600,画出OD600随时间变化的曲线即为工程菌在TBK培养基中好氧条件下的生长曲线。
在无氧、TBK条件下,以OD600 为纵轴,以培养时间为横坐标的生长曲线的绘制。首先将8个克隆分别接种于含卡那霉素的LB培养基中过夜培养,按1.0%的接种量接种于200μL含卡那霉素TBK培养基中,用50μL石蜡油液封,,具体设置方法见表2.8:
表2.8无氧、TBK条件下生长曲线测定方案
编号    碳源与诱导剂—:空白对照 L:乳糖 I:IPTG
放入酶标仪中自动检测,酶标仪的具体参数设置如表2.9:
表2.9厌氧培养时酶标仪的设置参数
参数    参数值
板类型    96 WELL PLATE
设置温度    设置点 30°C
    移至下一步骤前先预热
振板    线性: 0:20 (MM:SS)
    频率: 567 cpm (3 mm)
开始动力学    运行时间 48:00:00 (HH:MM:SS), 时间间隔 0:10:00, 289检测
检测    吸收光终点
    全板
    波长: 600
    检测速度: 正常, 延迟: 100 msec, 测量值/数据点: 8
结束动力学    
画出OD600随时间T/min变化的曲线即为工程菌在TBK培养基中厌氧条件下的生长曲线。
在无氧、TBK条件下,以OD600 为纵轴,以培养时间为横坐标的生长曲线的绘制。首先将克隆体接种于含卡那霉素的LB培养基中过夜培养,按1.0%的接种量接种于200μL含卡那霉素TBK培养基中,用50μL石蜡油液封,,具体设置方法见表2.10:
表2.10无氧、M9条件下生长曲线测定方案
编号    培养基G:葡萄糖 L:乳糖 I:IPTG
放入酶标仪中自动检测,酶标仪参数设置与表2.7相同,画出生长曲线。
2.30工程菌性状的稳定性与IPTG的诱导性
取转化一个月后工程菌,验证工程菌对乳糖,IPTG的表现性状,测试IPTG诱导能力,具体设置方案如表2.11:
表2.11工程菌的性状稳定性与IPTG诱导性验证方案
编号    LB培养基成分    培养时间    菌落颜色    颜色变化顺序
A    葡萄糖 X-gal    

24~48小时        
B    乳糖,X-gal            
C    乳糖,葡萄糖,X-gal            
D    乳糖,IPTG, X-gal            
E    乳糖,葡萄糖,IPTG,X-gal            

3.    实验方案、结果与分析
3.1实验方案
含有目的质粒的大肠杆菌Top10F在含有乳糖的培养基中生长,产生AHL,并且在IPTG的诱导下表达LuxR蛋白和LuxI蛋白。当培养基中AHL浓度达到一定值时就会激活LuxR产生LuxR*,LuxR*会启动质粒中的LacZα基因表达,产生β-半乳糖苷酶的α肽,与细菌基因组编码的β-半乳糖苷酶C端产生互补,组成有活性的β-半乳糖苷酶。这样就使得细菌能够利用培养基中的乳糖继续生长。以上就是目的质粒产生作用的分子生物学过程。在宏观上就是在细菌的种群的密度达到一个阈值后,原来不能利用乳糖的细菌开始可以利用乳糖。
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