模拟群体感应合作行为的基因回路的效果验证(6)
（6）待凝胶完全冷却凝固后，拔出梳子，将胶连同制胶器一起放入电泳槽，补加1×TAE 缓冲溶液，使液面高出凝胶表面约3-5mm。
注意不要让加样孔中有气泡。若有气泡，用细枪头轻轻捣出。
（7）剪1长条封口膜，用移液枪先后取4μL ddH2O、2μL6×溴酚蓝加样缓冲液和6μL待检测样品溶液，用枪头缓和均匀后，加入加样孔内。留出最左边加样孔加2μLMarker。加样时枪头要伸到液面以下，靠近加样孔，连续缓慢的加入样品，不要将琼脂戳破。
（8）接通电源，设置电压3~6V/cm，时间40min左右，开始电泳。一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA 样品由负极往正极泳动，即靠近加样孔的一端为负极。
（9）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。
（10）终止电泳后带上手套，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察电泳条带及其位置，并与marker进行比较，判断样品大小是否正确。
2.24 质粒的酶切
本课题中要对pEGFP-C1+质粒和pPopCtrl1质粒均使用限制性内切酶AatⅡ进行酶切，以产生相同黏性末端。AatⅡ酶切反应体系组分见表2.3：
表2.3AatⅡ酶切反应体系
反应物 体积
超纯水 6μL
缓冲液 2μL
DNA 10μL
AatⅡ 1μL
酶切反应条件：37℃，15min~30min即可。65℃，20min灭活酶，结束反应。
2.25 琼脂糖凝胶的回收
电泳后需要从琼脂糖凝胶中回收酶切的目的片段，pEGFP-C1+质粒酶切后回收490bp的片段，pPopCtrl1质粒酶切后回收3913bp的片段。割胶回收的具体步骤如下：
（1）在紫外灯下用干净锋利的手术刀片切下含有目的DNA 片段的凝胶，放入1.5ml 离心管中，称量算出凝胶块的重量。
注意：切胶时请尽量做到切下的含有目的DNA 片段的凝胶块体积尽可能小，凝胶块小于300mg，凝胶体积太大会影响DNA 回收率。观察DNA 条带时，请务必使用长波长紫外光，照射时间尽可能缩短，以减少紫外诱导突变。电泳时间可适当延长，从而使目的DNA 片段与其他DNA 片段尽可能分开，从而提高回收纯度。
（2）每100mg 琼脂糖凝胶加入400μL Binding Solution B，于50～60℃放置5～10min，每2-3min 间断混合，直至凝胶块完全融化。
注意：当回收小于500bp或大于4kb 的DNA 片段时，应在此溶液中再加入异丙醇，加入量为每100mg凝胶加入100μL异丙醇。
（3）将上述混合液体转移进入2ml 收集管的GenClean柱中，室温放置2min，6000 rpm 室温离心1min，取出GenClean柱，倒掉收集管中废液。对于贵重少量样品，可将收集管中的液体重新上柱并离心一次，可提高回收效率。
注意：Binding Solution B 为浅橙黄色溶液，可方便观察融胶过程是否充分；同时也作为系统指示剂，如果该步骤中溶液颜色呈粉红色，请加5μL 3M 醋酸钠（pH5.2），将溶液调回浅橙黄色，以保证DNA 回收效率。
（4）将GenClean柱重新放回收集管中，加入500μL Wash Solution，于12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。
（5）重复步骤4 一次。
（6）将GenClean柱重新放回收集管中，12,000 rpm，室温离心1min，以彻底去除Wash Solution。
注意：将GenClean柱室温开盖放置10min 或50℃放置5min，将有助于彻底去除Wash Solution 中的乙醇。
（7）将GenClean柱放入干净的1.5ml 离心管中，在GenClean柱的膜中央加入30～50μL Elution Buffer或超纯水, 37℃放置2min。12,000rpm 离心1min，离心管中的液体即为包含目的DNA 片段的溶液。
注意：将Elution Buffer 或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。
（8）取2～5μL进行电泳检测浓度，纯化好的DNA 可立即用于后续实验或于-20℃冻存。