(2)LB固体培养基:称取40.0 GL7002-LB Broth-250G粉末,加蒸馏水至1000mL,121℃高压灭菌15min,冷却到合适温度加入相应抗性的抗生素后倒平板;
(3)TBK培养基:称取10g胰蛋白胨,7gKCl,20.93gMOPS,溶解于1L蒸馏水中,调节pH至5.72左右, 121℃高压灭菌15min;
(4)5*M9培养基:取6.4gNa2PO4•7H2O,1.5gKH2PO4,0.25gNaCl,0.5gNH4Cl,加入蒸馏水100ml,加热过滤调PH至7.4,121℃高压灭菌15min;
(5)1M MgSO4:取2.46gMgSO4溶解于10ml蒸馏水,加热过滤,121℃高压灭菌15min;
(6)1M Ca2Cl2:取2.191克Ca2Cl2•6H2O溶解于10ml蒸馏水,加热过滤,121℃高压灭菌15min;
(7)20%葡萄糖溶液:4g葡萄糖,20ml蒸馏水,121℃高压灭菌15min;
(8)20%乳糖溶液:4g乳糖,20ml蒸馏水,121℃高压灭菌15min;
(9)100mmol/L的IPTG溶液:称取0.238g IPTG粉末溶于10ml超纯水中,经过细菌过滤器分装到小EP管中保存待用;
(10)2%的X-Gal溶液:称取2g X-Gal粉末溶于100ml二甲基酰胺(DMF)中,配置成为20mg/L的X-GAL溶液,分装于玻璃管中,-20°保存;
(11)卡那霉素的配制:称取500mg卡那霉素粉末溶于10ml超纯水中,经过细菌过滤器分装到小EP管中保存待用;
(12)氨苄青霉素的配制:称取500mg氨苄青霉素粉末溶于10ml超纯水中,经过细菌过滤器分装到小EP管中保存待用。

2.2实验方法

2.21 菌种的扩大培养
取两支已灭菌的试管,分别加入5mL含相应抗生素的LB液体培养基,用移液枪挑取少量甘油保藏的菌种含pEGFP-C1+质粒的DH5α菌和TOP10F’菌,接种于LB液体培养基。在37℃,250rpm的恒温振荡培养箱中过夜培养。

2.22 提取质粒
本课题需要提取pEGFP-C1+质粒和pPopCtrl1质粒,具体步骤如下:
(1)取1-3ml 过夜培养的菌液,12000rpm离心1分钟,去尽上清液。
(2)加入200μL SolutionⅠ,用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
(3)加入200μL SolutionⅡ,立即温和并充分地上下翻转混合4-6次,使菌体充分裂解,直至形成透亮的蛋清状溶液,此步骤不宜超过5min。
(4)加入350μL SolutionⅢ,温和并充分地上下翻转混合8-10次,室温放置2-5min。12,000rpm,离心10min。
(5)将步骤4中的上清液转移到2ml收集管内的GenClean Column中,室温6000rpm离心1 min,取出GenClean Column,倒掉收集管中废液。
(6)将GenClean Column重新放回收集管中,加入500μL SolutionⅣ,12,000rpm,室温离心1min,倒掉收集管中废液。
(7)将GenClean Column重新放回收集管中,加入500μL Wash Solution,12,000rpm,室温离心1min,倒掉收集管中废液。
(8)重复步骤7。
(9)倒掉收集管中废液,12000rpm,室温离心1min,彻底去除Wash Solution。
(10)将GenClean Column放入干净的1.5ml离心管中,向GenClean Column膜中央加入50-70μL Elution Buffer或超纯水,37℃放置2min,12,000rpm 室温离心1min,离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液,纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存备用。

2.23 琼脂糖凝胶电泳
对酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳,判断片段大小是否正确,同时为从胶中回收目的产物做准备。琼脂糖凝胶电泳具体步如下:
(1)用蒸馏水将电泳槽、制胶器和梳子冲洗干净、晾干,放在水平桌面上,在电泳槽中倒入稀释好的TAE电泳缓冲液。
(2)称量0.3g琼脂糖倒入干净的三角瓶中,量取30ml 1×TAE缓冲溶液加入三角瓶中,摇匀,在微波炉加热约45s,使瓶中的溶液沸腾持续约10s,取出三角瓶置室温冷却。
(3)待琼脂糖冷却至约50℃,用移液枪加入1μL EB,摇匀。
(4)将琼脂糖小心倒入制胶器,避免产生气泡,若有气泡轻轻用枪头赶出,迅速在一端插入梳子。
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